Muokatuista bakuloviruksista uusia mahdollisuuksia geenihoitoon Väitös molekulaarisen lääketieteen alalta 27.2.2010 Väittelijä FM Anssi Mähönen Väitösaika- ja paikka 27.2. 2010 klo 12, Tietoteknian auditorio, Kuopion kampus Anssi Mähönen kehitti väitöskirjatyössään uusia viruskuljettimia geeniterapian tarpeisiin. Uusilla bakuloviruskuljettimilla saadaan siirtogeenin ilmentymistä sekä tehostettua että pidennettyä. Näin mahdollistuu bakulovirusten laajempi käyttö turvallisessa ja tehokkaassa geeninsiirrossa. Bakulovirukset tarjoavat myös uusia mahdollisuuksia geeniterapiaan. Bakulovirukset ovat suuria sauvamaisia DNA-viruksia, joita on käytetty pitkään biotekniikassa muun muassa proteiinien tuottamiseen sekä rokotteiden valmistamiseen hyönteissoluissa. Bakulovirukset infektoivat luontaisesti ainoastaan niveljalkaisia, erityisesti tiettyjä perhoslajeja. Bakulovirukset soveltuvat näin hyvin geeninsiirtoon turvallisuutensa, suuren siirtokapasiteettinsa sekä nopean valmistettavuutensa vuoksi. Bakuloviruksen genomin muokkaus tehostaa siirtogeenin ilmentymistä Bakulovirusvälitteisessä geeninsiirrossa siirtogeenin ilmentyminen vaihtelee ja on yleensä heikompi muissa kuin maksaperäisissä soluissa. Väitöskirjatyössä kehitettiin virus, johon liitettiin metsämurmelin hepatiittiviruksen säätelyelementti (WPRE) osaksi siirtogeenin ilmentymiskasettia. Tulokset osoittivat, että siirtogeenin aikaansaama proteiinintuotto tehostui moninkertaisesti. Lisäksi solujen kasvatuksella oikeissa olosuhteissa havaittiin olevan merkittävä vaikutus geeninsiirtotehokkuuteen. Parhaimmillaan proteiinintuotto tehostui yli 60-kertaisesti, kun käytettiin optimoitua soluviljelyliuosta ja WPRE-elementin sisältävää bakulovirusta. Optimoitu soluviljelyliuos parantaa virusten geeninsiirtotehokkuutta Nisäkässolujen sisältämä tukiranka on olennainen ja tärkeä osa solun toimintaa. Tämä tukiverkosto säätelee muun muassa viruksen perimäaineksen kuljetusta solukalvolta tumaan. Väitöskirjatyössä havaittiin optimoidun soluviljelyliuoksen parantavan yleisesti eri virusten, kuten bakulo-, adeno- ja lentiviruksen, geeninsiirtotehokkuutta. Lisäksi havaittiin, että optimoitu soluviljelyliuos aikaansaa soluissa tukirangan uudelleenjärjestymistä. Tämä helpottaa bakuloviruksen pääsyä tumaan, mikä puolestaan parantaa siirtogeenin ilmentymistä. Hybridivirus pidentää siirtogeenin ilmentymisen kestoa Bakulovirusvälitteinen geeninsiirto saa nisäkässoluissa aikaan lyhytkestoisen, noin kaksi viikkoa jatkuvan siirtogeenin ilmentymisen. Geeniterapiaa ajatellen pidempikestoinen geenin ilmentyminen olisi kuitenkin joissain sovelluksissa toivottavaa. Bakuloviruksella on monia etuja, jotka puuttuvat tällä hetkellä käytössä olevista siirtogeenin pitkäkestoiseen ilmentämiseen kykeneviltä kuljettimilta. Väitöskirjatyössä kehitettiin useita erilaisia bakuloviruksen ja Epstein-Barrin viruksen sekamuotoja pitkäaikaista geeninilmentämistä varten. Alustavien soluviljelytulosten mukaan nämä uudet hybridikuljettimet pystyivät merkittävästi pidentämään merkkigeenin ilmentymistä verrattuna kontrollikuljettimeen. Lisätutkimukset ovat tarpeen, jotta voidaan osoittaa uuden kuljettimen toiminta myös eläinmalleissa. Optimoitu ja turvallinen rekombinaasin tuotto Cre-rekombinaasi on bakteriofaagi lambdan proteiini, jota voidaan käyttää biotekniikassa hyväksi DNA-molekyylien muokkauksessa. Pitkäkestoisen ja voimakkaan Cre-rekombinaasin tuoton tiedetään olevan haitallista nisäkässoluille. Väitöskirjatyössä havaittiin lisäksi, että Cre:tä ilmentävä, normaalisti nisäkässoluissa toimiva viruspromoottori CAG, toimi myös E. coli-bakteerisoluissa. Tämä aiheutti vakavia ongelmia hybridikuljettimen kehittelyssä. Nämä ongelmat ratkaistiin parantamalla Cre:n ilmenemiskasettia siten, että ilmentyminen tapahtui vain nisäkässoluissa ja oli sekä väliaikaista että rajoitettua. Uutta ilmenemiskasettia voidaan käyttää kaikissa Cre-loxP -teknologian sovellutuksissa, kuten transgeenisten eläinten tuotossa. Filosofian maisteri Anssi Mähösen väitöskirja The Challenge of Enhanced and Long-term Baculovirus-mediated Gene Expression in Vertebrate Cells (Haasteena tehostettu ja pitkäkestoinen bakulovirusvälitteinen geenien ilmentyminen nisäkässoluissa) tarkastetaan Itä-Suomen yliopiston terveystieteiden tiedekunnassa. Vastaväittäjänä on professori Arto Urtti Helsingin yliopiston Lääketutkimuksen keskuksesta ja kustoksena akatemiaprofessori Seppo Ylä-Herttuala Itä-Suomen yliopistosta. Väittelijän painokelpoinen kuva on osoitteessa http://www.uef.fi/uef/vaitoskuvat Lisätietoja: Anssi Mähönen, p. 040 034 1534, anssi.mahonen@uef.fi © Itä-Suomen yliopistoPalaute