Bus Simulator 21 keskittyy ensisijaisesti linja-autojen ajamiseen kaupunkien reittejä pitkin. Linjurien tulee pysyä aikataulussa ja tarjota matkustajilleen turvallinen julkisen liikenteen kokemus. Asiaa mutkistaa muu liikenne sekä etenkin ruuhka-aikojen haastavat tilanteet. Myös asiakkaisiin liittyvät tilanteet, kuten liputta kulkevat ja lujalla äänenvoimakkuudella musiikkia kuuntelevat matkustajat, tai tukitut bussipysäkit ja tahritut istuinpaikat aiheuttavat ongelmia, jotka pitää ratkoa.

Linja-autovalikoima on monipuolinen ja kattaa peräti 30 erilaista vaihtoehtoa monilta kansainvälisesti tunnetuilta automerkeiltä. Näitä ovat muun muassa Volvo, Scania, Mercedes-Benz, Setra, IVECO BUS ja MAN. Valikoimaa täydentävät suomalaisittain vähemmän tunnetut merkit, kuten Alexander Dennis, BYD, Grande West ja Blue Bird. Lisäksi ensimmäistä kertaa pelisarjan historiassa pelaajalla on mahdollisuus ajaa kaksikerroksisia linja-autoja ja sähköbusseja.