Hiipakka | Akateeminen Kirjakauppa

Src homology (SH3) 3-domeenit ovat pieniä, keskimäärin 60 aminohappoa käsittäviä proteiinien toiminnallisia osayksiköitä. Ne säätelevät monia soluille tärkeitä proteiinien välisiä vuorovaikutuksia, erityisesti sellaisia, joilla on merkitystä solun signaalinvälityksessä sekä kasvun ja erilaistumisen säätelyssä. SH3-domeeneja sisältäviä proteiineja tavataankin usein erilaisissa sairauksissa, kuten syövässä. Myös monet mikrobit, kuten kuten ihmisen immuunikatovirus 1 (HIV-1), osaavat käyttää hyväkseen SH3-välitteisiä tapahtumia, joilla on merkitystä muun muassa tämän viruksen aiheuttamassa immuunikadossa (AIDS). SH3 domeenit pystyvät sitoutumaan kohdeproteiinissaan olevaan proliinirikkaaseen alueeseen (niin sanottuun PxxP-motiiviin), mutta sitoutumisen voimakkuus (affiniteetti) ja sitoutumiskumppanin valinta (spesifisyys) on monissa tapauksissa melko heikkoa. Tutkimukset HIV-1:n Nef-proteiinin ja Hck-tyrosiinikinaasin SH3-domeenin interaktiosta ovat osoittaneet, että SH3/PxxP sitoutumisaffiniteetin ja -spesifiteetin muodostumiseen vaikuttavat suuresti myös SH3-PxxP sitoutumisalueen ulkopuoliset molekulaariset kontaktit. Erityisesti SH3-domeenissa oleva, sekvenssiltään vaihtelevan, RT-silmukaksi kutsutun alueen on osoitettu olevan tärkeä tekijä SH3-domeenien ligandispesifisyyden määräytymisessä. Väitöskirjatyössä tutkittiin HIV-1:n Nef proteiinin SH3-sitoutumisessa sekä muissa proteiinivuorovaikutuksissa tarvittavien aminohappojen roolia tarkastelemalla Nef (mutanttien) kykyä sitoa Hck tyrosiinikinaasin SH3 domeenia pintaplasmoniresonanssitekniikalla sekä näiden mutaatioiden vaikutusta Nef:in kykyyn assosioitua seriini/treoniinikinaasi PAK2:n kanssa soluissa. Niiden aminohappojen, jotka vaikuttivat Nef:in kykyyn sitoa SH3-domeeneja havaittiin olevan kriittisiä myös sen sitoessa PAK2:a. Toisena pääkohtana työssä tutkittiin SH3-domeenin RT-silmukkarakenteen osuutta SH3-välitteisten proteiinivuorovaikutusten affiniteetin ja spesifisyyden määräytymisessä. Tätä varten kehitettiin suuri joukko muunneltuja SH3-domeeneja (RRT-SH3) sattumanvaraistamalla kuusi aminohappoa Hck SH3 domeenin RT-silmukasta ja ilmentämällä niitä bakteriofaagien pinnalla. Tällä phage display-menetelmällä pystyttiin valikoimaan keinotekoisia RRT-SH3-domeeneja, jotka sitoutuivat Nefiin hyvin korkealla affiniteetilla luonnolliseen Hck SH3-domeeniin verrattuna. Lisäksi samalla menetelmällä seulottiin RRT-SH3-domeeneja, jotka sitoutuivat tiukasti myös sellaisiin proteiineihin (SIV239mac Nef, HIV-1 Nef F90R variantti), jotka eivät luonnollisesti sido Hck:n SH3-domeenia. Nämä tulokset tukivat oletusta, että RT-silmukalla voidaan vaikutttaa sekä SH3-domeenin sitoutumiskumppanin valintaan että sitoutumisen voimakkuuteen. Seuraavaksi selvitettiin, voidaanko näitä eri Nef-proteiineilla valikoituja keinotekoisia RRT-SH3-domeeneja käyttää Nef-proteiinin biologisten toimintojen estäjinä. Työssä havaittiin, että valikoidut RRT-SH3-domeenit sitoutuvat voimakkaasti eri Nef-proteiineihin soluissa sekä pystyivät estämään Nef:in SH3-riippuvaisia funktioita. Hck SH3:n luonnolliset substraatit eivät juurikaan sitoutuneet näihin muunneltuuihin SH3-domeeneihin solumallissa. Muokattuja SH3-domeeneja voitaisiin tulevaisuudessa hyödyntää sekä SH3-välitteisten prosessien perustutkimuksessa että käyttää molekyylimalleina SH3-domeenien toimintaan perustuvassa lääkekehittelyssä ja geeniterapiassa.